基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒的檢測(cè)步驟介紹

更新時(shí)間：2022-08-27

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　　1、制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10×substrateG并使之稀釋10倍，混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

　　2、待測(cè)樣品：切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker即可。

　　3、低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

　　4、洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi).可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10ml1×BufferA(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2×30分鐘。中間換液。

　　5、孵育：加入10ml1×BufferB(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC孵育1~5小時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小時(shí)即可顯示。如MMP活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過(guò)一夜。

　　6、顯色：倒掉BufferB，加入凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。

　　7、條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色.MMP條帶則為白色。

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