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文章標(biāo)題《骨肉瘤中GRM4基因表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化的研究及其研究意義》

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研究背景：骨肉瘤是zui常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤。對(duì)于那些在診斷的時(shí)候沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者,

其5年生存率可達(dá)70%。盡管取得了許多進(jìn)展,然而其余的有轉(zhuǎn)移的或者對(duì)化療不敏感的骨肉瘤患

者,其5年生存率只有20%左右。骨肉瘤的真正病因尚不清楚,其發(fā)生發(fā)展過程是一個(gè)包括環(huán)境因

素和遺傳因素的多因素過程。表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)展表明,表觀遺傳改變可引起骨肉瘤的惡

性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展,讓我們可以更好地了解這種腫瘤的分子機(jī)制。代謝型谷氨酸受體4(mGluR4)主要

是突觸前谷氨酸受體,其在控制運(yùn)動(dòng)的基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路的數(shù)個(gè)關(guān)鍵位置表達(dá),參與突觸前興奮性

谷氨酸信號(hào)的神經(jīng)傳遞。研究表明代謝型谷氨酸受體4(mGluR4)在多種腫瘤中表達(dá)并與其進(jìn)組預(yù)

后相關(guān),在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中mGluR4的表達(dá)表明谷氨酸信號(hào)參與骨形成和骨吸收過程中的細(xì)

胞分化與調(diào)控。目的：研究表明在骨肉瘤中代謝型谷氨酸受體4(mGluR4)呈高表達(dá)狀態(tài)。本研究

檢測(cè)63例骨肉瘤患者的骨組織和105例非腫瘤患者的骨組織中GRM4基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)以及表

達(dá)情況,探討GRM4基因啟動(dòng)子甲基化與其表達(dá)的關(guān)聯(lián)及其在骨肉瘤中的研究意義。方法：研究對(duì)

象及標(biāo)本：收集2010年1月-2012年7月期間在廣西醫(yī)科大學(xué)*附屬醫(yī)院診療的骨肉瘤患者組織

標(biāo)本63例。所有患者術(shù)前未進(jìn)行相關(guān)抗癌治療措施,所有標(biāo)本經(jīng)過病理學(xué)檢查確認(rèn)為骨肉瘤。取

得的標(biāo)本在切除后立即置入液氮罐冷凍保存,然后轉(zhuǎn)到-80℃條件下低溫保存。取得105例非腫瘤

患者的骨組織作為對(duì)照組,同樣經(jīng)液氮冷凍低溫保存,后轉(zhuǎn)到-80℃低溫冰箱保存用于基因甲基

化、RNA和蛋白測(cè)定。并且收集患者的研究和組織學(xué)資料,如年齡、性別、Enneking分期、轉(zhuǎn)

移、腫瘤部位、組織學(xué)類型。所有患者均進(jìn)行隨訪,術(shù)后前2年內(nèi)每2個(gè)月進(jìn)行1次隨訪,在接下來

的隨訪過程中每6個(gè)月隨訪一次,平均隨訪時(shí)間為20個(gè)月(1月-36月)。這項(xiàng)研究由廣西醫(yī)科大學(xué)

附屬*醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),每一位患者在告知的情況下簽署知情同意書。GRM4基因啟動(dòng)子甲

基化的測(cè)定：通過焦磷酸測(cè)序的方法檢測(cè)骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4基因啟動(dòng)子

的甲基化狀態(tài)。GRM4基因mRNA表達(dá)的測(cè)定：通過RT-PCR的方法測(cè)定骨肉瘤組織及非腫瘤患者的

骨組織中GRM4基因的mRNA水平的表達(dá)。GRM4基因蛋白表達(dá)的測(cè)定：通過Western Blot(WB)的方

法測(cè)定骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4基因的蛋白水平的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用

SPSS 16(IBM,Armonk,NY,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來比較骨肉瘤組織和癌旁組織

的甲基化水平、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的差異。用斯皮爾曼相關(guān)性(Spearman correlation)檢測(cè)

GRM4基因甲基化和基因表達(dá)之間的相關(guān)性。GRM 4甲基化水平與研究病理特征(包括年齡,性別,

階段,外科分期,病理組織學(xué)類型,位置,和轉(zhuǎn)移)之間的關(guān)系則用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。

應(yīng)用Kaplan-Meier分析和Log-rank檢驗(yàn)分析骨肉瘤患者的總生存期(OS)、無復(fù)發(fā)生存率(RFS)和

無進(jìn)展生存期(PFS),其中需要排除在末次隨訪仍然存活的患者。P值<0.05,被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

義。結(jié)果：在骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4基因啟動(dòng)子甲基化的情：通過焦磷酸測(cè)

序的方法檢測(cè)GRM4基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。在骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中平均甲基化

水平分別是3.79±0.83%和4.08±0.74%,其中P<0.05。這說明相對(duì)于非腫瘤患者的骨組織而言,

在骨肉瘤組織中GRM4基因啟動(dòng)子表現(xiàn)為低甲基化。在骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4

mRNA水平的表達(dá)情況：用RT-PCR的方法檢測(cè)骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4 mRNA水平

的表達(dá)情況。在骨肉瘤組織中GRM4 mRNA的灰度值為1.71±0.15,而在正常骨組織中其值為

0.56±0.13,P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其結(jié)果表明與非腫瘤患者的骨組織中相比,在骨肉瘤組織中

GRM4mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)。在骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4蛋白水平的表達(dá)情況：用免

疫印跡分析方法(WB)的方法檢測(cè)骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4蛋白水平的表達(dá)情

況。在骨肉瘤組織中的值為1.28±0.08,而在正常骨組織中其值為0.35±0.05,P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)

意義。其結(jié)果表明與非腫瘤患者的骨組織中相比,在骨肉瘤組織中GRM4蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)。