鏈霉親和素的突變體-瓊脂糖凝膠

1 、產(chǎn)品介紹

Strep-Tactin 2 NUPharose FF是鏈霉親和素的突變體（Strep-Tactin2配基）和瓊脂糖凝膠偶聯(lián)形成的和層析分離介質(zhì)，用于分離、純化StrepII或Twin Strep標(biāo)簽蛋白。Strep II標(biāo)簽為8個氨基酸的小標(biāo)簽（WSHPQFEK），一般不影響融合后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，常用于融合表達(dá)蛋白質(zhì)的檢測和純化。Twin Strep標(biāo)簽為兩個StrepII串聯(lián)的標(biāo)簽，相比Strep II標(biāo)簽，Twin Strep標(biāo)簽與Strep-Tactin 2配基的親和力更高。

本產(chǎn)品的Strep-Tactin 2配基與上一代Strep-Tactin 配基相比，對Strep II標(biāo)簽的親和力進一步提高，與生物-素的親和力大幅削弱。因而本產(chǎn)品能夠更牢固的結(jié)合Strep II融合蛋白，在融合蛋白表達(dá)豐度較低時，相對捕獲量更高，載量和得率更高。在洗脫方面，可以使用生物-素進行洗脫，比采用昂貴的脫硫生物-素洗脫更經(jīng)濟，且使用后可采用10~50 mM NaOH進行再生。本產(chǎn)品對Strep II標(biāo)簽具有高度特異性，一般只需一步純化就能獲得高純度的蛋白質(zhì)樣品。

2 、產(chǎn)品特點與技術(shù)指標(biāo) 

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測試條件為：10%流穿，大腸桿菌表達(dá)的帶Strap II 標(biāo)簽的增強型綠色熒光蛋白，6 min 停留時間。

 3 、Strep II 、Twin Strep 標(biāo)簽親和層析

Strep-Tactin 2 NUPharose FF對Strep II、Twin Strep標(biāo)簽蛋白的特異性結(jié)合以及純化過程如圖1和圖2所示。

4 、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。Strep-Tactin 2 NUPharose FF的壓縮比為1.15 。為使達(dá)到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時使用裝柱器），為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝 柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3 MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰 穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門/堵 頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測定和評價

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。

4.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

Strep-Tactin 2 NUPharose FF填料的工作pH范圍為6~10，推薦下述緩沖液A為平衡與上樣緩沖液。樣品需作澄清處理，并用緩沖液A稀釋或者換液成緩沖液A。

緩沖液A：100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，pH8.0。平衡5個柱體積，建議流速為～150 cm/h上樣流速為50~150cm/h，較小的流速有利于載量的提高，可根據(jù)實際結(jié)合情況選擇流速，能獲得較好的效果。

4.4 再平衡

上樣后用緩沖液A再平衡5~10 CV，或平衡至基線，洗去雜質(zhì)，推薦流速為~150cm/h。

4.5 洗脫（Elution）

推薦含10~50 mM的D-生物-素作為洗脫緩沖液，如下述的緩沖液B。

緩沖液B：50mM d-Biotin，100 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mM EDTA，pH8.0。 用洗脫緩沖液洗6-10 CV，建議流速為～150 cm/h。

4.6 再生（Regeneration）

在一次或多次使用后，需要對填料進行再生：水，3~5 CV，～150cm/h；10~50 mM NaOH，3 CV，3 min接觸時間；水，3~5 CV，～150 cm/h；再用緩沖液A平衡5~ 10 CV，150 cm/h。

4.7 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在2~8 ℃為宜，不可凍存